核酸分析

核酸分析的工作原理是什么？主要有两类测量原理。吸光度分析使用 1 mm 或 0.5 mm 光程的微量比色池，在核酸强烈吸收的 260 nm 处读数，并将结果换算为标准 10 mm 光程。A260 为 1.0 约相当于双链 DNA 50 µg/mL、单链 DNA 33 µg/mL 和 RNA 40 µg/mL，260/280 与 260/230 比值可指示蛋白质或盐类污染。荧光法使用与双链 DNA 或总 RNA 特异性结合的染料，信号仅来自目标分子，因此对蛋白质、盐类和游离核苷酸的耐受性更好。毛细管电泳在筛分聚合物中分离片段，给出以碱基对表示的片段长度和摩尔浓度。自动工作站将测量与移液结合，可将样品稀释至目标浓度。## 核酸分析有哪些型号？- 微量紫外核酸分析仪：在基座上测量 1 至 2 µL 样品、读取 260、280 和 230 nm 的分光光度计，数秒内给出浓度和纯度比值。- 荧光核酸定量系统：使用双链 DNA 或 RNA 特异性染料的荧光计，可在 1 至 20 µL 样品中定量低至数皮克的核酸，并耐受会干扰吸光度读数的蛋白质、盐类和游离核苷酸。- 全自动毛细管电泳核酸分析仪：将样品进样至填充筛分聚合物的毛细管，并逐样品报告片段长度、摩尔浓度和完整性数值的仪器。- 核酸定量用荧光微孔板读数仪：使用染料化学体系在 96 或 384 孔板中定量 DNA 或 RNA 的读数仪，通量高且样品消耗少。- 自动核酸定量与均一化工作站：自动测量浓度并将每份样品稀释至目标值的机器人平台，直接产出可供 qPCR 或测序使用的均一化板。## 如何选择合适的型号？根据所需的选择性选择方法。吸光度法快速、成本低，足以满足常规质粒或 PCR 检查，但无法区分 DNA 与 RNA，且受蛋白质、酚类和盐类影响。荧光染料对双链 DNA 或 RNA 具有选择性，最低可检测数皮克，适合测序文库和产量很低的样品。毛细管电泳可提供分光光度计无法给出的片段大小和完整性信息，对文库插入片段大小和 RNA 完整性尤为重要。随后由通量决定在单管设备、微孔板读数仪和兼具测量与均一化功能的自动工作站之间选择。检查最小样品体积、检测限、线性范围、所需标准品以及数据系统可接受的导出格式。## 核酸分析用于哪些领域？核酸分析广泛用于二代测序文库质量控制、qPCR 前模板定量、质粒和寡核苷酸质量检查、RNA 完整性和纯度评估、筛检组合的样品均一化。## 适用哪些标准与认证？核酸分析相关工作通常依据 ISO 20395、ISO 13485 manufacturing、MIQE guidelines、CLSI MM06-A2、IEC 61010-1、IVDR (EU) 2017/746。CE 等仪器认证需按具体配置逐项确认，不作默认承诺。## 采购前需要考虑哪些要点？应使用与样品相同的缓冲液进行空白校准，因为不同缓冲液的吸光度不同，含胍盐或 EDTA 的洗脱液会给出误导性比值。保持测量基座清洁，并在样品之间擦拭以避免残留，同时定期用参考标准品检查微量测量的准确性。荧光检测需要新鲜配制的标准品，染料试剂需避光，且基于染料的浓度值取决于检测化学体系，因此不应比较不同试剂盒的结果。进行片段分析时，应严格按供应商要求制备样品和分子量标记，因为离子强度会影响进样。洗脱后的核酸应低温保存，避免反复冻融，并为每份样品记录浓度、比值和检测方法。