荧光核酸定量系统

什么是荧光核酸定量系统？使用双链 DNA 或 RNA 特异性染料的荧光计，可在 1 至 20 µL 样品中定量低至数皮克的核酸，并耐受会干扰吸光度读数的蛋白质、盐类和游离核苷酸。## 概述

荧光定量系统使用选择性染料化学体系，例如用于双链 DNA 的 PicoGreen、用于 RNA 的 RiboGreen 或用于单链 DNA 的广谱染料。用同一试剂盒制备的二至五点标准曲线将荧光值换算为浓度，各试剂盒定义各自的线性范围，高灵敏试剂盒通常为 0.2 至 1,000 ng/mL，小体积模式可达 1,000 ng/µL。激发和发射滤光片与染料匹配，通常为约 480 nm 蓝光激发、约 520 nm 绿光发射，配专用适配器时样品体积可低至 1 µL。由于染料仅报告目标分子，粗裂解液与纯化样品的测定结果较为接近，有利于测序和 qPCR 的均一化。## 工作原理是什么？主要有两类测量原理。吸光度分析使用 1 mm 或 0.5 mm 光程的微量比色池，在核酸强烈吸收的 260 nm 处读数，并将结果换算为标准 10 mm 光程。A260 为 1.0 约相当于双链 DNA 50 µg/mL、单链 DNA 33 µg/mL 和 RNA 40 µg/mL，260/280 与 260/230 比值可指示蛋白质或盐类污染。荧光法使用与双链 DNA 或总 RNA 特异性结合的染料，信号仅来自目标分子，因此对蛋白质、盐类和游离核苷酸的耐受性更好。毛细管电泳在筛分聚合物中分离片段，给出以碱基对表示的片段长度和摩尔浓度。自动工作站将测量与移液结合，可将样品稀释至目标浓度。## 主要特点有哪些？- 对双链 DNA 或 RNA 具有选择性的染料化学体系。- 每个反应可检测低至数皮克。- 二至五点标准曲线，使用试剂盒自带对照品。- 配适配器时样品体积可低至 1 µL。- 激发和发射滤光片匹配常用染料。- 对蛋白质、盐类和核苷酸污染敏感度较低。## 技术参数有哪些？典型的荧光核酸定量系统配置：激发波长为 470-490 nm；发射波长为 510-530 nm；检测限为 0.2 ng/mL with high-sensitivity kit；线性范围为 0.2-1,000 ng/mL, extended with small-volume mode；样品体积为 1-20 µL；校准方式为 2-5 point standard curve per kit。以上数值代表该产品类别的常见水平，具体配置参数以报价单及随机校准文件为准。## 适用于哪些应用？荧光核酸定量系统主要用于测序文库定量、低产量 DNA 或 RNA 样品测量、qPCR 前模板均一化、提取核酸的质量控制。在更广泛的核酸分析类别中，实验室还将其用于二代测序文库质量控制、qPCR 前模板定量、质粒和寡核苷酸质量检查。## 适用哪些标准与认证？相关标准与方法包括 ISO 20395、ISO 13485 manufacturing、MIQE guidelines、CLSI MM06-A2、IEC 61010-1、IVDR (EU) 2017/746。本型号的认证候选包括 CE、ISO 9001 manufacturing、IEC 61010-1 test report；每项认证均需针对具体配置在发货前确认，仅提供已实际签发的证书。应使用与样品相同的缓冲液进行空白校准，因为不同缓冲液的吸光度不同，含胍盐或 EDTA 的洗脱液会给出误导性比值。保持测量基座清洁，并在样品之间擦拭以避免残留，同时定期用参考标准品检查微量测量的准确性。荧光检测需要新鲜配制的标准品，染料试剂需避光，且基于染料的浓度值取决于检测化学体系，因此不应比较不同试剂盒的结果。进行片段分析时，应严格按供应商要求制备样品和分子量标记，因为离子强度会影响进样。洗脱后的核酸应低温保存，避免反复冻融，并为每份样品记录浓度、比值和检测方法。## 如何选择合适的荧光核酸定量系统？当样品较稀、受到污染或只需计算双链 DNA（如测序文库）时，选择荧光计。确认激发和发射滤光片与所用染料试剂盒匹配，并核对线性范围上下限与预期浓度是否相符。运行成本估算中应包含试剂盒消耗。### 与其他核酸分析型号相比如何？根据所需的选择性选择方法。吸光度法快速、成本低，足以满足常规质粒或 PCR 检查，但无法区分 DNA 与 RNA，且受蛋白质、酚类和盐类影响。荧光染料对双链 DNA 或 RNA 具有选择性，最低可检测数皮克，适合测序文库和产量很低的样品。毛细管电泳可提供分光光度计无法给出的片段大小和完整性信息，对文库插入片段大小和 RNA 完整性尤为重要。随后由通量决定在单管设备、微孔板读数仪和兼具测量与均一化功能的自动工作站之间选择。检查最小样品体积、检测限、线性范围、所需标准品以及数据系统可接受的导出格式。