实时荧光定量 PCR 系统

什么是实时荧光定量 PCR 系统？在每循环测量荧光以实现闭管定量的 96 孔仪器，支持基因表达分析、病原体载量测定以及结合标准曲线的检测方法验证。## 概述

实时荧光定量 PCR 系统将 96 孔加热模块与光学模块结合，光学模块激发荧光染料并每循环读取一次发射光。常用化学体系包括 SYBR Green I 等嵌入染料和序列特异性水解探针，仪器提供二至六个光学通道及匹配的 LED 和滤光片组合。软件将荧光转换为扩增曲线，通过基线阈值设定确定循环阈值，并根据扩增效率约 90% 至 110% 的标准曲线计算浓度。染料类实验通常在反应后进行熔解曲线分析以确认单一产物。数据处理包括内参基因归一化、平行样平均、熔解温度报告以及面向 MIQE 的导出字段。温度均匀性和光学精度决定平行样品的一致程度。## 工作原理是什么？PCR 使用 Taq 等热稳定 DNA 聚合酶、两条位于靶标两侧的引物、脱氧核苷三磷酸和缓冲液来拷贝目标序列。加热模块使反应在约 95 °C（双链 DNA 解链）、50 至 65 °C（引物退火）和 72 °C（延伸）之间循环。重复 25 至 45 个循环可使产物每轮翻倍，因此在试剂耗尽前扩增呈指数增长。终点法热循环仪在反应结束后用凝胶或毛细管系统检测产物，实时荧光仪器则每循环用嵌入染料或水解探针测量荧光，循环阈值反映起始模板量。定量结果需要标准曲线或内参基因，熔解曲线分析用于检查产物特异性，或通过高分辨率熔解检测序列变异。RNA 靶标需增加逆转录步骤。## 主要特点有哪些？- 96 孔模块，配二至六个光学通道。- LED 激发，配匹配的发射滤光片。- 支持嵌入染料和水解探针。- 循环阈值和标准曲线分析软件。- 熔解曲线模块，用于染料法特异性检查。- 内参基因归一化和面向 MIQE 的数据导出。## 技术参数有哪些？典型的实时荧光定量 PCR 系统配置：模块规格为 96 x 0.2 mL, 384-well option；光学通道为 2-6, LED with filter sets；激发波长范围为 450-680 nm；发射波长范围为 500-730 nm；温度范围为 4-99 °C；温度均匀性为 ±0.3 °C at 72 °C。以上数值代表该产品类别的常见水平，具体配置参数以报价单及随机校准文件为准。## 适用于哪些应用？实时荧光定量 PCR 系统主要用于基因表达和转录本定量、病原体载量测定、microRNA 和拷贝数分析、检测方法验证和扩增效率检查。在更广泛的 PCR 仪类别中，实验室还将其用于基因表达分析和转录本定量、临床和食品样品中的病原体检测、基因分型和突变筛查。## 适用哪些标准与认证？相关标准与方法包括 ISO 13485 manufacturing、MIQE guidelines、CLSI MM03-A2、CLSI MM06-A2、IEC 61010-1、IVDR (EU) 2017/746。本型号的认证候选包括 CE、ISO 13485 manufacturing、IVDR (EU) 2017/746；每项认证均需针对具体配置在发货前确认，仅提供已实际签发的证书。扩增前和扩增后的操作应在不同区域进行，并使用专用移液器和滤芯吸头，因为扩增产物残留是假阳性的主要原因。用新鲜次氯酸盐或经验证的除污剂清洁台面和设备，条件允许时使用紫外照射，并经常更换手套。每年用标准温度计和染料板校准加热模块温度和光学通道，并检查整块模块的均匀性。每次运行用阳性、阴性对照和标准曲线验证性能，并记录 Ct 值、扩增效率和熔解温度。引物和探针应按推荐温度分装小份保存，避免反复冻融，荧光探针需避光。## 如何选择合适的实时荧光定量 PCR 系统？当需要定量、病原体载量测定或方法验证且每循环荧光数据必不可少时，选择该系统。将光学通道数量与多重检测需求比较，并检查通道间串扰。确认模块均匀性、以每反应拷贝数表示的灵敏度、升降温速率以及所需的分析功能。报价中应包含软件许可和确认文件包。### 与其他 PCR 仪型号相比如何？首先确定需要定性检测、相对或绝对定量还是序列变异区分，这决定在终点法热循环仪与实时荧光和熔解分析系统之间的选择。其次确定光学通道数量，多重检测组合需要二至六个通道及匹配的滤光片组。通量取决于板式：96 孔适合多数实验室，384 孔板和自动化适合高通量筛查。检查加热模块类型、最大升降温速率、温度均匀性和梯度功能，这些有助于优化新引物组。用于现场检测时，应考虑体积、供电方式和环境温度耐受性。确认分析软件、导出格式、引物探针支持情况以及质量体系所需的验证文件。