长读长文库制备系统

什么是长读长文库制备系统？长读长文库制备系统在最少片段化和 PCR 的前提下将高分子量 DNA 转化为文库，为纳米孔或单分子测序平台保留数十至数百 kb 的读长，适用于读长本身即为关键参数的场景。## 概述

长读长文库制备避免使用短读长流程中的机械剪切和短扩增子 PCR。高分子量 DNA 先经纯化去除短片段，然后进行末端修复并连接携带马达蛋白或测序引物的接头。快速试剂盒把裂解、纯化和接头连接合并，约 10–60 分钟完成，移液步骤极少；连接法试剂盒产量更高，但步骤更多。可选条码使单个流动池可容纳多个样品。关键变量是 DNA 长度、纯度和移液次数，因为每次转移都会打断长分子。超长方案可使用细胞核或完整细胞作为起始样品。构建文库前应通过脉冲场电泳或毛细管电泳确认大部分片段长度超过 50 kb。## 工作原理是什么？测序文库是两侧带已知接头序列的 DNA 片段集合，测序仪可识别这些接头。制备从片段化开始，可通过酶切、转座酶切割或超声处理获得既定大小分布。末端修复和 3' 端加腺嘌呤使末端可连接，随后通过连接反应接上带样品索引的接头，或在使用转座酶时直接引入接头。利用磁珠或非凝胶法进行片段筛选，去除目标区间之外的片段，再通过有限循环 PCR 富集文库并补齐索引序列。各步骤之间用磁珠纯化去除酶、盐和短片段。制备 RNA 文库时，先在反转录和链特异性第二链合成之后进入相同流程。制备完成后通过荧光法测浓度、毛细管电泳测片段大小分布进行质量控制。## 主要特点有哪些？- 最少片段化处理，保留 100 kb 以上读长 - 快速试剂盒在一小时内完成纯化与接头连接 - 连接法试剂盒产量更高，适合要求严格的应用 - 可选条码使单个流动池容纳多个样品 - 超长方案可使用细胞核或完整细胞 - 宽口吸头与轻柔混匀减少 DNA 断裂

技术参数有哪些？典型的长读长文库制备系统配置：起始 DNA 量为 100 ng–1 µg high molecular weight；起始片段大小为 over 50 kb recommended；所得读长为 10 kb–100 kb typical；方案时间为 approx. 10–60 min (rapid kit) or 2–4 h (ligation kit)；是否需要 PCR 为 No for native workflows；条码为 Up to 24 samples per run with barcoding kits。以上数值代表该产品类别的常见水平，具体配置参数以报价单及随机校准文件为准。## 适用于哪些应用？长读长文库制备系统主要用于复杂基因组全基因组组装、人类样品结构变异检测、全长转录本测序、宏基因组与环境样品测序。在更广泛的文库制备系统类别中，实验室还将其用于全基因组与外显子组文库构建、RNA 测序文库制备、单细胞与低起始量文库流程。## 适用哪些标准与认证？相关标准与方法包括 ISO 20395、ISO 15189、CLSI MM09、IEC 61010-1、ISO 17025。本型号的认证候选包括 CE、ISO 9001 manufacturing、IEC 61010-1 safety；每项认证均需针对具体配置在发货前确认，仅提供已实际签发的证书。文库制备应在与扩增后区域和测序区域分开的 PCR 前区进行，并使用不会离开该区域的专用移液器、管架和试剂。此前文库带来的污染会表现为异常的索引组合，因此每批应设置无模板对照，并监测不同运行之间的索引跳跃。试剂对冻融敏感，酶应分装并记录批号。新试剂盒或自动化脚本在常规使用前，应针对参考样品验证产量、插入片段大小和文库复杂度。由于文库产量决定测序数据质量，应保留能把每个文库与其样品、索引、试剂盒批号和操作者关联起来的记录，以便审核时可追溯。## 如何选择合适的长读长文库制备系统？当测序平台需要天然 DNA 且读长是关键指标时，应选择长读长文库制备系统。询价时应注明起始量及片段大小、试剂盒化学体系、条码容量、是否提供自动化配置，以及开始前用于确认高分子量 DNA 的质量控制方法。### 与其他文库制备系统型号相比如何？应从测序平台和起始样品入手。短读长仪器需要与流动池化学体系匹配的接头文库，长读长仪器则需要高分子量起始样品并尽量减少 PCR。估算每样品起始量，因为低起始量和单细胞流程需要专门的化学体系。随后在以下方案之间选择：偶尔使用的手工试剂盒；每批 8–96 个样品、可无人值守运行的磁珠自动化；以及可处理数百个样品并整合浓度归一与混合的全液体处理平台。还应确认片段化方式、索引类型与多重水平、片段筛选方法、所需设备（如磁力架或恒温混匀仪），以及供应商是否提供针对你所处样品类型的经验证方案。手工文库制备是批次效应的常见来源，样品量大时自动化通常更划算。