单细胞文库制备系统

什么是单细胞文库制备系统？单细胞文库制备系统将数千个单细胞分配到液滴或微孔中，为每个细胞的转录本加上条码，并构建能把分子追溯到来源细胞的测序文库，用于细胞图谱、肿瘤异质性和免疫谱研究。## 概述

该系统把微流控或微孔卡盒与试剂结合，将单个细胞、带条码的凝胶珠和反转录预混液共同包裹。每个条码标识一个细胞，唯一分子标识符标记每条转录本，从而可通过计算去除 PCR 重复。包裹完成后破除液滴，扩增 cDNA 并构建带独立索引的短读长测序文库。典型运行在单个通道内处理 500–10,000 个细胞，目标回收率为 50–80%，多重细胞率随上样量升高。数据通过专用流程分析，用于过滤低质量细胞、聚类表达谱并注释细胞类型。由于流程时间短且对操作时长、温度和细胞活率敏感，应在加载前立即计数并评估细胞状态。## 工作原理是什么？测序文库是两侧带已知接头序列的 DNA 片段集合，测序仪可识别这些接头。制备从片段化开始，可通过酶切、转座酶切割或超声处理获得既定大小分布。末端修复和 3' 端加腺嘌呤使末端可连接，随后通过连接反应接上带样品索引的接头，或在使用转座酶时直接引入接头。利用磁珠或非凝胶法进行片段筛选，去除目标区间之外的片段，再通过有限循环 PCR 富集文库并补齐索引序列。各步骤之间用磁珠纯化去除酶、盐和短片段。制备 RNA 文库时，先在反转录和链特异性第二链合成之后进入相同流程。制备完成后通过荧光法测浓度、毛细管电泳测片段大小分布进行质量控制。## 主要特点有哪些？- 微流控或微孔分配，单轮处理 500–10,000 个细胞 - 带条码凝胶珠将每条转录本归属到细胞 - 唯一分子标识符校正 PCR 重复 - 目标细胞回收率 50–80%，上样量可调 - 整合 cDNA 扩增与文库构建 - 分析软件支持细胞过滤、聚类与注释

技术参数有哪些？典型的单细胞文库制备系统配置：单轮细胞数为 500–10,000 per channel；细胞回收率为 50–80% (target)；多重细胞率为 approx. 1–10% depending on loading；通量为 up to 8 channels in parallel (model dependent)；所需细胞活率为 over 80% (recommended)；细胞大小范围为 approx. 5–40 µm (kit dependent)。以上数值代表该产品类别的常见水平，具体配置参数以报价单及随机校准文件为准。## 适用于哪些应用？单细胞文库制备系统主要用于单细胞转录组图谱、肿瘤异质性与克隆分析、免疫细胞谱与受体测序、发育与干细胞研究。在更广泛的文库制备系统类别中，实验室还将其用于全基因组与外显子组文库构建、RNA 测序文库制备、单细胞与低起始量文库流程。## 适用哪些标准与认证？相关标准与方法包括 ISO 20395、ISO 15189、CLSI MM09、IEC 61010-1、ISO 17025。本型号的认证候选包括 CE、ISO 9001 manufacturing、IEC 61010-1 safety；每项认证均需针对具体配置在发货前确认，仅提供已实际签发的证书。文库制备应在与扩增后区域和测序区域分开的 PCR 前区进行，并使用不会离开该区域的专用移液器、管架和试剂。此前文库带来的污染会表现为异常的索引组合，因此每批应设置无模板对照，并监测不同运行之间的索引跳跃。试剂对冻融敏感，酶应分装并记录批号。新试剂盒或自动化脚本在常规使用前，应针对参考样品验证产量、插入片段大小和文库复杂度。由于文库产量决定测序数据质量，应保留能把每个文库与其样品、索引、试剂盒批号和操作者关联起来的记录，以便审核时可追溯。## 如何选择合适的单细胞文库制备系统？当生物学问题需要单细胞分辨率而非群体平均结果时，应选择单细胞文库制备系统。询价时应注明单轮细胞数、通道数、回收率与多重细胞率目标、支持的应用（如基因表达或免疫谱分析）、细胞活率要求，以及仪器配套的分析流程。### 与其他文库制备系统型号相比如何？应从测序平台和起始样品入手。短读长仪器需要与流动池化学体系匹配的接头文库，长读长仪器则需要高分子量起始样品并尽量减少 PCR。估算每样品起始量，因为低起始量和单细胞流程需要专门的化学体系。随后在以下方案之间选择：偶尔使用的手工试剂盒；每批 8–96 个样品、可无人值守运行的磁珠自动化；以及可处理数百个样品并整合浓度归一与混合的全液体处理平台。还应确认片段化方式、索引类型与多重水平、片段筛选方法、所需设备（如磁力架或恒温混匀仪），以及供应商是否提供针对你所处样品类型的经验证方案。手工文库制备是批次效应的常见来源，样品量大时自动化通常更划算。