可固定活性染料试剂

什么是可固定活性染料试剂？可固定活性染料是胺反应性荧光染料，共价标记膜受损的死细胞，并能耐受固定和破膜。将其在固定前加入表面染色的细胞，使死细胞在胞内染色或长流程染色中可被排除于分析之外。## 概述

胺反应性活性染料含有琥珀酰亚胺酯基团，可与蛋白质上的游离胺基反应。膜完整的活细胞仅标记表面胺基，保持较暗，而死细胞使染料得以接触丰富的胞内胺基，产生亮 10 至 50 倍的染色。由于是共价结合，标记可在甲醛固定和去污剂破膜后保持，这与碘化丙啶或 7-AAD 不同。染料有多种颜色，分别由紫外、紫色、蓝色、红色和远红激光器激发，通常以冻干形式供应，用 DMSO 复溶后，在无蛋白缓冲液中以 1:1000 稀释使用。染色应在不含蛋白的缓冲液中进行，因为血清中的胺基会淬灭染料。排除死细胞可去除非特异性结合物，从而提高检测组合质量，这类染料是胞内细胞因子和转录因子染色的标准配置。## 工作原理是什么？流式细胞术试剂使细胞特性以光学信号的形式可被检测。偶联了 FITC、PE、APC 或串联染料和聚合物染料等荧光素的单克隆抗体结合特定抗原，激光激发的荧光强度与抗原密度成正比。核酸染料和胺反应性染料可区分活细胞与死细胞，因为膜受损的细胞会摄入 DNA 染料或暴露更多的胺基。校准和补偿微球通过捕获基团结合抗体，或携带确定的荧光素含量，为补偿矩阵和标准化提供一致的阳性和阴性群体。固定通常采用甲醛使蛋白交联，而用去污剂或醇类破膜可使抗体到达胞内或核内靶点。裂解液通过渗透压或氯化铵裂解去除红细胞，同时保留白细胞的散射特性。## 主要特点有哪些？- 共价胺基标记，可耐受甲醛固定和破膜 - 活细胞与死细胞荧光差异为 10 至 50 倍 - 有适配紫外、紫色、蓝色、红色和远红激光器的颜色 - 冻干剂型，可在零下 20 摄氏度长期稳定保存 - 典型用法为在无蛋白缓冲液中 1:1000 稀释 - 兼容胞内细胞因子和转录因子染色方案

技术参数有哪些？典型的可固定活性染料试剂配置：反应化学为 Amine-reactive succinimidyl ester；激发选项为 UV, 405, 488, 633/640 nm；剂型为 Lyophilized, reconstitute in DMSO；典型工作稀释度为 1:1000；染色时间为 15–30 min at 2–8 °C；活/死分离度为 10- to 50-fold。以上数值代表该产品类别的常见水平，具体配置参数以报价单及随机校准文件为准。## 适用于哪些应用？可固定活性染料试剂主要用于胞内细胞因子染色、转录因子染色、磷酸化流式流程、细胞治疗产品活率检测、长流程多步染色。在更广泛的流式细胞术试剂类别中，实验室还将其用于免疫表型分析检测组合、活/死细胞鉴别、仪器补偿和质控。## 适用哪些标准与认证？相关标准与方法包括 CLSI H62、CLSI H43、ISO 20391-2、ISO 13485 (IVD reagent manufacturing)、EU IVDR 2017/746、ISAC MIFlowCyt。本型号的认证候选包括 ISO 9001 manufacturing、RUO labeling、REACH compliance；每项认证均需针对具体配置在发货前确认，仅提供已实际签发的证书。抗体和染料应在 2 至 8 摄氏度避光储存，切勿冷冻串联染料，否则会降解并造成溢出。每批新抗体都应进行滴定，并在实验记录中登记批号。必要时使用 Fc 受体封闭，设门时应包含荧光减一对照、同型或生物学对照。应新鲜配制甲醛溶液，并针对每个表位验证固定时间。含叠氮化物的缓冲液和裂解试剂应依据当地化学品法规处置，因为叠氮化钠可在管道中形成爆炸性金属叠氮化物。用于受监管检测时，应采购带分析证书的试剂，更换供应商或克隆时应重新验证检测组合。## 如何选择合适的可固定活性染料试剂？只要细胞在染色后会被固定或破膜，就应选择可固定活性染料。对于未固定的活细胞分析，碘化丙啶或 7-AAD 等较简单的 DNA 染料已足够。应选择不占用检测组合最亮通道的颜色，并在询价中说明激光器、包装规格和储存要求。### 与其他流式细胞术试剂型号相比如何？应根据仪器的激光器和滤光片选择试剂，因为荧光素必须能被所用配置激发和检测。将亮度高的荧光素分配给低密度抗原，亮度低的分配给丰富抗原，并避免串联染料之间的光谱重叠。确认抗体克隆、种属反应性以及针对流式细胞术的已验证应用。对于胞内或磷酸化靶点，应选择相容的固定和破膜缓冲液。每个检测组合都应包含活性染料，并为每种荧光素选用相容的补偿微球。核查批间一致性文件、2 至 8 摄氏度的储存条件、有效期，以及受监管检测所需的散装或冻干规格的供应情况。应在自己的细胞中对每种抗体进行滴定，以确定最佳染色浓度。