数字 PCR 系统

什么是数字 PCR 系统？数字 PCR 系统将每个反应分割成数千个微滴或微腔室，并对阳性分区计数，无需标准曲线即可对核酸绝对定量。用于稀有突变检测、微小残留病、拷贝数分析和标准物质定值。## 概述

在微滴式格式中，油包水乳液发生器为每个样本产生 20000 个或更多微滴，经热循环后由微滴读取仪通过双色荧光逐个读取。芯片式系统使用具有 20000 个或更多固定分区的纳米孔阵列。泊松统计将阳性与总分区的比例转换为每微升拷贝数并给出置信区间。该方法可分辨接近 0.1% 的变异等位基因比例，对 PCR 抑制剂耐受，并用于为其他检测校准标准品。流程包括微滴生成、在标准热循环仪上循环和读取，96 个样本需 4 至 6 小时。通量和单样本成本高于实时 PCR，因此在精度至关重要时才使用 dPCR。## 工作原理是什么？分子诊断通过扩增特定核酸序列使其可被检测。在实时 PCR 中，热循环使 DNA 变性、引物退火并由 DNA 聚合酶延伸，同时水解探针等荧光探针发出与产物累积成正比的信号，循环阈值指示起始量。RNA 靶标先进行逆转录。LAMP 等等温方法在约 60–65 °C 的恒温下扩增。数字 PCR 将样本分割成数千个微滴或微孔，对阳性分区计数以绝对定量。测序通过合成或纳米孔检测读取碱基顺序。内对照和无模板对照等质控在每次运行中验证提取、扩增和污染状态。## 主要特点有哪些？- 每个反应分割成 20000 个或更多微滴或纳米孔 - 无需标准品即可按每微升拷贝数绝对定量 - 可检测接近 0.1% 的变异等位基因比例 - 双色荧光，支持双重检测 - 分区降低 PCR 抑制剂影响 - 软件带泊松校正和置信区间

技术参数有哪些？典型的数字 PCR 系统配置：每反应分区数为 20,000–26,000；分区类型为 Droplets or nanowell chip；荧光通道为 2–6；样本体积为 20–40 µL per reaction；每次运行样本数为 8–96；动态范围为 ≈ 1–100,000 copies/µL。以上数值代表该产品类别的常见水平，具体配置参数以报价单及随机校准文件为准。## 适用于哪些应用？数字 PCR 系统主要用于肿瘤稀有突变检测、微小残留病监测、拷贝数变异分析、标准物质定值、液体活检研究。在更广泛的分子诊断设备类别中，实验室还将其用于传染病 PCR 检测、肿瘤突变检测、遗传和遗传病检测。## 适用哪些标准与认证？相关标准与方法包括 ISO 15189、IEC 61010-2-101、CLSI MM03、CLSI MM06、CLSI EP17、ISO 20395、ISO 13485、ISO 17822。本型号的认证候选包括 CE、ISO 13485 quality system、ISO 9001 manufacturing；每项认证均需针对具体配置在发货前确认，仅提供已实际签发的证书。分子实验室需要单向工作流程，适用时设置试剂准备、样本处理、扩增和扩增后等独立区域，或使用降低污染风险的封闭系统。使用专用移液器、滤芯吸头、紫外去污和例行表面清洁。校准热模块和光学系统，每次运行均设阳性、阴性和内对照。保护仪器免受灰尘和振动，使用稳定电源，并遵守试剂冷链要求。依据 CLSI MM 指南和 ISO 15189 下的实验室程序验证检测和仪器性能。管理病原体工作的生物安全，并对数据进行隐私控制，尤其是遗传信息。## 如何选择合适的数字 PCR 系统？当绝对定量或检测约 0.1% 的稀有变异至关重要时，应选择数字 PCR。询价时应说明分区类型、通道数、每次运行样本数、流程自动化、检测可获得性、软件验证和每个反应的耗材成本。### 与其他分子诊断设备型号相比如何？应根据检测类型、样本量和实验室技术水平选择。实时 PCR 适合采用开放或封闭检测的大样本量批量检测。样本到结果的卡式系统人工操作时间极少，适用于小批量或紧急检测，出结果快。数字 PCR 适用于绝对定量、稀有变异检测和微小残留病。等温分析仪适合仪器简单的分散式场所。测序仪适合广泛的遗传、肿瘤和病原体基因组套餐。比较通道数、通量、样本量、检出限、流程步骤、污染控制以及结果判读软件。核实检测项目在所在市场的可获得性和注册、开放通道的通用性、LIS 连接和服务支持，并规划实验室分区和人员培训。