梯度实时荧光定量 PCR 系统

什么是梯度实时荧光定量 PCR 系统？梯度实时荧光定量 PCR 系统将模块上的温度梯度与荧光检测结合，使退火优化与熔解曲线特异性检查在同一次运行中完成。适合希望无需跑胶即可优化引物和探针条件的 qPCR 检测开发人员。## 概述

该系统将具备梯度功能的 Peltier 模块与多通道荧光模块结合。梯度运行时，各列以不同温度退火，实时荧光显示 Cq 值、扩增效率和终点信号随梯度的变化。扩增后的熔解曲线可判断每一列产生的是单一特异性产物还是引物二聚体，因此无需凝胶分析。典型梯度跨度为 12 列上 1–20 °C，具有两至四个光学通道。该平台也可运行标准 qPCR 方案，因此可作为通用 qPCR 系统使用。灵敏度和动态范围与标准 96 孔 qPCR 相当，但应使用经校准探头验证梯度准确度，因为光学和热学校准都需要。## 工作原理是什么？梯度热循环仪采用 Peltier 模块，两端独立加热制冷，或设置多个温区，使模块上形成线性温度分布。典型梯度范围为 1–30 °C，因此 12 列的 96 孔模块一次运行可测试 12 个不同退火温度，例如 50–65 °C。沿模块布置的温度传感器向控制器反馈，软件计算每一列的实际温度。另一种设计采用三至六个独立控温区，为每个区提供确定温度而非连续梯度，从而提高设定点的准确性。运行结束后通过凝胶电泳或熔解曲线比较扩增产物，找出特异性产量最高的退火温度。## 主要特点有哪些？- 带实时荧光读取的梯度退火 - 熔解曲线分析替代凝胶电泳 - 显示 Cq 与扩增效率随温度的变化 - 两至四个光学通道 - 也可运行标准 qPCR 方案 - 配备光学与热学校准工具

技术参数有哪些？典型的梯度实时荧光定量 PCR 系统配置：模块规格为 96 × 0.2 mL wells；梯度跨度为 1–20 °C；梯度分辨率为 12 columns；光学通道为 2 to 4；激发光源为 LED；最大升降温速率为 3–4 °C/s。以上数值代表该产品类别的常见水平，具体配置参数以报价单及随机校准文件为准。## 适用于哪些应用？梯度实时荧光定量 PCR 系统主要用于 qPCR 检测开发、引物与探针优化、基于熔解曲线的特异性筛选、检测验证研究。在更广泛的梯度 PCR 仪类别中，实验室还将其用于引物退火温度优化、聚合酶与缓冲体系比较、多重 PCR 开发。## 适用哪些标准与认证？相关标准与方法包括 IEC 61010-1、IEC 61010-2-010、ISO 20395、ISO 22174、CLSI MM19。本型号的认证候选包括 CE、ISO 9001 manufacturing；每项认证均需针对具体配置在发货前确认，仅提供已实际签发的证书。安装时应使用多点探头在若干设定梯度下验证梯度性能，因为模块两端的准确度可能与中心不同。保持模块清洁，并确保所有管和板完全就位，以保证热接触。优化与常规运行应使用同一类板，因为管壁厚度会影响孔内实际温度。应记录最佳退火温度及其所在列。优化后将方案转移到常规热循环仪时应验证性能是否一致，因为不同模块可能存在细微差异。保持 PCR 前后区域分离，并对测试的每个温度设置无模板对照。## 如何选择合适的梯度实时荧光定量 PCR 系统？当开发 qPCR 检测并希望在一次运行中完成优化和特异性读取时，可选择梯度实时荧光定量系统。其价格高于仅梯度或仅 qPCR 的机型。询价时应说明梯度跨度、通道数、熔解曲线分辨率、支持的报告染料、梯度分析软件，以及所需的光学和热学校准文件。### 与其他梯度 PCR 仪型号相比如何？首先在线性梯度与多温区设计之间选择。线性梯度适合用 8 或 12 个温度进行简单的引物优化，而独立温区的设定点更精确，并允许各区运行不同方案。应核对梯度跨度、最大温差、梯度步数，以及梯度是否适用于每个循环步骤，包括变性和延伸。还应考虑模块规格、升降温速率，以及是否需要实时光学模块以便用熔解曲线确认特异性。同时关注软件能否显示各列计算温度并将梯度条件与方案一起保存。对于共享实验室，双模块梯度机型可增加容量。应使用经校准的多点探头验证梯度准确度。